引言：蛋白质高级结构的界面危机
在生物医药领域，蛋白质类治疗药物（如单克隆抗体、重组蛋白和融合蛋白等）的研发与制造是一场针对“结构稳定性”的持久战。
与化学小分子药物不同，蛋白质的治疗活性高度依赖于其复杂的高级结构（Higher-Order Structure, HOS）。这种结构主要由氢键、疏水相互作用、静电引力和范德华力等弱相互作用维持，在制造工艺和长期存储中极易受到物理应力的破坏。
在产品的全生命周期中，蛋白质溶液不可避免地会接触到多种界面：
- 固-液界面（不锈钢、塑料、玻璃、滤膜）
- 液-气界面（顶部空间、气泡）
- 液-液界面（硅油微滴）
蛋白质具有极强的界面吸附倾向，这种行为不仅会导致有效浓度的损失（Target concentration loss），更严峻的挑战在于，界面吸附往往伴随着构象的重排和去折叠，进而诱发蛋白质聚集和亚可见微粒的形成。
本文将针对过滤工艺中的非特异性结合、玻璃包装的理化风险、以及弹性密封件的复杂交互进行深度拆解，并探讨基于处方设计的缓解策略。
一、 过滤工艺中的非特异性结合：高表面积下的浓度陷阱
过滤是生物药下游生产中的核心工序，涵盖了超滤/纳滤（UF/DF）、病毒过滤以及最终除菌过滤。滤膜巨大的表面积与药液接触，使得非特异性吸附（Non-specific binding, NSB）成为影响收率和稳定性的关键因素。
1.1 滤膜材质与吸附动力学
滤膜通常由聚醚砜（PES）、聚偏氟乙烯（PVDF）或纤维素衍生物制成。尽管这些材料常经过亲水化改性，但残余的疏水位点仍会与蛋白质的疏水畴结合。
- PES滤膜： 因其高通量而广泛应用，但其聚合物骨架具有较高的疏水性。研究表明，在未添加表面活性剂的情况下，PES对单克隆抗体的初始吸附量可达到每平方厘米数毫克量级。
- 低浓度产品的挑战： 对于超强效、低浓度（如 < 1 mg/mL）的蛋白质制剂，滤膜吸附导致的浓度损失尤为显著。实验数据表明，在无保护处方下，除菌过滤后的初段滤液浓度可能下降 20%-50%，直到滤膜表面的吸附位点达到饱和（Satuation）。
1.2 滤膜淤积与流体剪切
吸附不仅导致蛋白损失，还会改变滤膜的物理特性。
- 通量衰减（Flux Decline）： 蛋白质在膜孔内部的吸附会导致有效孔径减小，增加过滤阻力。
- 剪切应力诱导聚集： 当滤膜发生局部淤积时，膜孔内的局部剪切速率（Shear rate）会显著升高。文献指出，这种高剪切环境会加剧吸附态蛋白的脱落，并诱发溶液中可溶性高分子量物（HMW）的增加。研究显示，切向流过滤（TFF）过程中，如果系统压力控制不当，产生的亚可见微粒数量会随过滤循环次数呈指数级增长。
二、 玻璃包装系统的理化风险：沥滤物与脱片的双重威胁
虽然中性硼硅玻璃（Type 1 Glass）被视为注射剂包装的金标准，但其在生物大分子制剂中的表现并非完全惰性。玻璃表面的化学不均一性及特定离子的沥滤，是诱发蛋白聚集的隐形推手。
2.1 玻璃脱片（Delamination）的机制与危害
玻璃脱片是指从玻璃容器内表面剥离出的微薄硅酸盐薄片（玻璃鳞片）。
- 诱发因素： 在玻璃管材拉制成瓶的过程中，底部和肩部受热剧烈，导致碱性金属氧化物（如氧化钠）向表面富集。这种富碱层在长期接触药液（特别是 pH > 8.0 或含有磷酸盐、柠檬酸盐缓冲液）时会发生离子交换，导致局部腐蚀。
- 对蛋白的影响： 脱落的玻璃微片提供了巨大的活性表面，蛋白质会吸附在其边缘并以此为“晶种”发生聚集。数据表明，含有玻璃脱片风险的样品，其亚可见微粒（$\ge 10 \mu m$）计数可从正常的 < 100 个/mL 飙升至数千个/mL。
2.2 金属离子沥滤及其触发效应
玻璃包装会向制剂中释放微量的金属离子，其中铝离子（Al³⁺）和来自预灌封注射器针头制造工艺的钨（W）残留最受关注。
- 铝离子引发的连环反应： 文献引用研究指出，玻璃沥滤出的铝离子浓度即使在 ppb（十亿分之一）级别，也能作为核化因子诱发处方中聚山梨酯降解产物（游离脂肪酸）沉淀。这些脂肪酸微晶进而通过界面吸附诱导蛋白质聚集。
- 钨诱导的强力聚合： 在预灌封注射器（PFS）成型过程中，真空成型针头残留的钨氧化物对蛋白质具有极高的亲和力。实验显示，在含有 100-500 ppb 钨残留的溶液中，某些单抗药物在数周内即可观察到明显的蛋白质沉淀，且这种聚集通常是不可逆的。
三、 弹性密封件：化学与物理的复杂交互作用
橡胶塞和柱塞作为初级包装系统的组成部分，通过物理吸附、化学浸出和润滑剂迁移三种途径干扰蛋白质的稳定性。
3.1 硅油（PDMS）：界面稳定的动态破坏者
为了保证推力和密封性，预灌封注射器和胶塞必须进行硅化处理。
- 疏水吸附中心： 游离的硅油微滴在溶液中形成了无数微小的液-液界面。蛋白质倾向于将其疏水核心暴露并附着在硅油液滴表面。
- 数据支撑： 研究发现，含有 0.5 mg/mL 游离硅油的制剂在经过轨道振荡（Agitation）测试后，其亚可见微粒产生的速率比无硅油对照组快 5-10 倍。更重要的是，蛋白质与硅油结合形成的复合物颗粒具有极强的免疫原性潜能，能够增强树突状细胞的摄取。
3.2 有机浸出物（Leachables）的化学干扰
弹性密封件是由多种聚合物、硫化剂、促进剂和抗氧剂组成的复杂混合体。
- pH 偏移与氧化： 橡胶组分中的有机小分子可能迁移至药液中，导致溶液 pH 值发生微小但关键的漂移（如 $\Delta pH > 0.2$）。此外，某些提取物具有氧化活性，会攻击蛋白质残基（如甲硫氨酸、半胱氨酸），改变其疏水性分布，间接增强界面吸附。
- 氟聚合物涂层的利弊： 为了阻隔浸出物，现代工艺常在胶塞表面覆盖一层 ETFE 或 PTFE 膜。虽然这显著降低了化学风险，但文献提到，利用 FTIR 显微成像发现，在受压和振动环境下，氟聚合物薄膜本身可能剥离产生微米级的固体微粒，这些微粒同样会成为蛋白质吸附的基质。
四、 处方优化策略：构建界面保护屏障
面对避无可避的界面压力，理性的处方设计通过化学手段干扰“吸附-展开-聚集”这一链式反应。
辅料、降低蛋白质吸附的作用机制、优势及关键考量要点
| 辅料类别 | 作用机制 | 优势 | 局限性 |
|---|---|---|---|
| 表面活性剂 | 1. 与蛋白质竞争界面空间 2. 与蛋白质形成复合物以减少吸附 3. 将蛋白质从界面置换出来 4. 改变表面性质（如降低表面能、形成空间位阻屏障） |
1. 防止蛋白质吸附的效果显著 2. 适配多种溶液条件 3. 所需浓度低 4. 可提高蛋白质稳定性与溶解度 5. 对多种界面均有效 |
1. 存在化学不稳定性（易水解、氧化） 2. 效果受缓冲液、pH、离子强度及界面类型影响 3. 会被硅化表面降解或自身发生降解 4. 需具备高亲水亲油平衡值（HLB）才能充分发挥作用 |
| 环糊精 | 1. 与蛋白质形成包合物 2. 与蛋白质竞争界面空间 |
1. 提升蛋白质的热稳定性与构象稳定性 2. 适配多种溶液条件 3. 可能与其他辅料产生协同作用 |
1. 界面稳定效果较弱 2. 部分衍生物会降低蛋白质稳定性 3. 与其他辅料联用后效果更佳 4. 作用具有特异性，效果有限且存在差异 5. 存在与二糖、多元醇类似的降解风险 |
| 氨基酸 | 1. 抑制疏水作用与静电相互作用 2. 发挥分子拥挤效应 3. 改变表面性质（如降低界面张力） 4. 将蛋白质从界面解吸附 |
1. 提高蛋白质稳定性与溶解度 | 1. 作用具有特异性，效果有限且存在差异 2. 所需浓度高 3. 可能降低蛋白质稳定性 4. 需复配使用才能发挥理想效果 |
| 白蛋白 | 1. 与蛋白质竞争界面空间 2. 可置换已吸附的蛋白质 3. 改变表面性质（如提高亲水性） |
1. 易吸附于各类表面 2. 适配多种表面与溶液条件 |
1. 稳定性极差，易发生自聚集 2. 可能形成不均匀的异质层 3. 需搭配其他辅料维持自身稳定性 4. 可能与治疗性蛋白质发生相互作用，改变其生物活性 |
| 二糖与多元醇 | 1. 形成保护性水化层，提高蛋白质稳定性 2. 提高溶液黏度 3. 高黏度可降低蛋白质在水溶液中的迁移率 |
1. 提升蛋白质的热稳定性与构象稳定性 2. 适配多种溶液条件 |
1. 特定条件下易发生降解 2. 需搭配表面活性剂才能达到充分稳定效果 3. 稳定效果有限 |
| 缓冲液 | 1. 维持溶液pH值 2. 改变表面性质（如表面电荷） 3. 改变蛋白质表面电荷或疏水性 4. 调控蛋白质与界面间的电荷失衡 |
1. 优化后可减少蛋白质吸附 2. 抑制蛋白质解折叠与聚集，维持其稳定性 3. 种类丰富 |
1. 缓冲液的选择对减少稳定性负面影响至关重要 2. 难以平衡表面与蛋白质的化学性质 3. 稳定效果有限 4. 存在浓度效应 5. 效果受界面类型影响 |
| 等渗调节剂 | 1. 维持溶液离子强度与渗透压 2. 改变蛋白质表面电荷或疏水性 3. 屏蔽蛋白质与界面间的相互作用 |
1. 适配多种溶液环境与表面 | 1. 种类选择或浓度不当会导致蛋白质不稳定、溶解度下降或吸附增加 2. 可能符合霍夫迈斯特序列效应 3. 存在浓度与pH效应 4. 稳定效果有限 5. 效果受界面类型影响 |
4.1 表面活性剂的竞争与阻隔
非离子表面活性剂（如聚山梨酯 80, 20 或泊洛沙姆 188）是制剂中的首要防御线。
- 作用机制： 表面活性剂分子比蛋白质更小、扩散更快，能抢先占据滤膜、玻璃壁或硅油滴表面的活性位点。
- 浓度选择： 通常需超过其临界胶束浓度（CMC），以确保有足够的分子覆盖新生界面。
4.2 氨基酸与糖类的协同保护
- 精氨酸（Arginine）： 它是目前最有效的抗吸附辅料之一。精氨酸通过与蛋白质表面残基弱结合，增加了吸附过程的活化能，从而减缓蛋白质向界面的不可逆粘附。
- 优先溶剂化： 蔗糖和海藻糖通过增加水的表面张力，使蛋白质分子被“排挤”到本体溶液中，减少其向界面的扩散趋势，从而维持其折叠态。
4.3 新型活性剂的探索
鉴于聚山梨酯易氧化降解产生微粒，行业正在探索更稳定的替代品。
- FM1000： 一种新型的非离子表面活性剂，具有极快的界面吸附动力学，能有效抵御高速分装过程中的剪切应力。
- 环糊精（HP-$\beta$-CD）： 它能包裹蛋白质表面的疏水残基，显著降低其在硅油界面的附着力。
制剂研发、灌装后处理及储存环节中影响蛋白质稳定性的关键因素总结
| 操作环节（Operation） | 界面类型（Interface） | 潜在应激源（Potential stressor） | 影响（Impact） |
|---|---|---|---|
| 批量冻融（Bulk freeze-thaw） | 冰-液、气-液、固-液 | 冷冻浓缩、冰晶形成、辅料结晶、温度变化、带电/极性界面 | 蛋白质变性/聚集、pH偏移、界面解折叠/聚集 |
| 制剂/混合（Formulation/mixing） | 气-液、液-液、固-液 | 剪切力、带电/极性界面、起泡、辅料损失/降解、原料杂质、可沥滤物 | 剪切诱导蛋白质膜破裂、相分离、界面解折叠/聚集、蛋白质稳定性降低、微粒污染 |
| 过滤（Filtration） | 固-液、气-液 | 小孔隙、空气截留、剪切力、压力、辅料损失/降解、可沥滤物、过滤器成分 | 目标浓度降低、界面解折叠/聚集、过滤器堵塞/破裂、微粒污染、蛋白质稳定性降低 |
| 灌装（Filling） | 固-液、气-液、固-固 | 剪切力、空化作用、起泡、截留、温度变化、可沥滤物、带电/极性界面、光照、辅料损失/降解 | 剪切与截留诱导蛋白质膜破裂、蛋白质解折叠/聚集、微粒污染、蛋白质稳定性降低、氧化 |
| 包装/贴标（Packaging/labelling） | 气-液、固-液 | 搅拌、光照、温度变化 | 蛋白质变性、聚集、颗粒形成 |
| 运输（Transport） | 气-液、固-液、油-液 | 机械应力、空化作用、容器/密封界面、温度变化 | 冲击诱导蛋白质膜破裂、蛋白质解折叠、聚集、过冷药物制剂可能冻结、硅油污染、乳光与沉淀 |
| 储存（Storage） | 气-液、固-液、油-液 | 容器/密封相互作用、可沥滤物、带电/极性界面、辅料-容器/密封不相容、辅料损失/降解、机械应力、冰箱振动 | 颗粒脱落、硅油污染、界面诱导解折叠/聚集/颗粒形成、玻璃薄片形成、蛋白质变性、聚集 |
结论：整体设计的必要性
蛋白质吸附并非一个孤立的化学反应，而是一个受制造工艺、包装系统和处方组分共同调控的动力学过程。文献明确指出，解决界面吸附问题不能单纯依赖于添加某种活性剂，而需要采取整体设计（Rational Design）的方法。
参考文献：
Downey, J. D., Crean, A. M., & Ryan, K. B. (2025). Impact of protein adsorption during biopharmaceutical manufacture & storage. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 209, 107071.
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