前言
在生物制药过程中，从上游细胞培养到下游纯化、制剂，过滤操作几乎贯穿所有环节。作为直接接触药物的关键材料，其安全性直接关系到药物的质量。然而，滤器中可能存在的E/L成分，如生产过程中残留的单体、添加剂、降解产物等，可能迁移到药物中，与药物中的活性成分（如蛋白质）发生相互作用，导致药物稳定性下降、有效性降低，甚至产生不良反应。
因此，对滤器进行充分的E/L研究，识别潜在的风险成分，并采取有效的控制措施，是保障生物药物质量的关键环节。
一、己内酰胺与双酚A——滤器E/L
己内酰胺
来源主要是聚酰胺材料生产过程中的残留单体和滤器使用过程中的降解产物。
聚酰胺是一类常用的合成高分子材料，广泛应用于各种过滤器中。在聚酰胺的生产过程中，己内酰胺是其单体，在聚合反应中，部分己内酰胺可能未完全反应而残留，或因聚酰胺降解而产生。
这些残留或降解产生的己内酰胺可以以单体或低聚物的形式存在，并从滤器中迁移出来，成为E/L成分。
双酚A
来源主要是聚碳酸酯（Polycarbonate, PC材料生产过程中的残留单体和滤器使用过程中的降解产物。
聚碳酸酯同样是一种常用的高分子材料，具有良好的透明度和耐冲击性。双酚A是聚碳酸酯的单体，在聚碳酸酯的生产过程中，可能存在未完全反应的单体残留。此外，聚碳酸酯在使用过程中也可能发生降解，释放出双酚A。
需要注意的是，由于双酚A具有一定的环境和健康风险，部分聚碳酸酯材料可能会采用不含双酚A的替代品，但在E/L研究中仍需关注其潜在的替代物风险。
接下来，将深入探讨己内酰胺低聚物和双酚A如何独立作用于蛋白，破坏其稳定性。
二、己内酰胺低聚物：多重“攻击”破坏蛋白稳定性
研究表明，己内酰胺低聚物通过多种作用力与蛋白结合，破坏其构象，并诱导聚集。
1.多作用力驱动的蛋白结合与构象破坏
己内酰胺低聚物可通过氢键、疏水作用、静电作用等多种非共价键与蛋白直接结合，从多个角度攻击蛋白的稳定结构。
- 氢键攻击： 低聚物中的酰胺基团（-NH-CO-）可与蛋白的羰基（C=O）、羟基（-OH）形成氢键，破坏蛋白原有的二级结构稳定网络，例如α-螺旋的氢键维系，导致蛋白结构松动。
- 疏水攻击： 低聚物的疏水性侧链能与蛋白疏水口袋结合，诱导蛋白疏水区域暴露，进而引发蛋白分子间的疏水聚集，使蛋白“抱团取暖”，最终形成聚集体。
- 静电攻击： 己内酰胺低聚物带负电的特性，可与蛋白表面带正电的氨基酸残基（如赖氨酸、精氨酸）发生静电相互作用，改变蛋白表面电荷分布，降低颗粒间排斥力，促进聚集体形成。
这种多作用力的协同作用，会直接导致蛋白二级结构（如α-螺旋、β-折叠）解旋，甚至引发三级结构重构，最终破坏蛋白稳定性。
2.对蛋白聚集的直接诱导效应
研究表明，PA滤器的己内酰胺低聚物是导致rh-GCSF（重组人粒细胞集落刺激因子）聚集的关键因素。实验数据显示，仅添加己内酰胺低聚物的rh-GCSF制剂出现单体峰肩峰（提示聚集体生成），且峰面积随低聚物浓度升高而增加；而未添加低聚物的对照组无此现象。
这一结果直接证明，己内酰胺低聚物无需其他E/L成分协同，即可独立诱导蛋白聚集，且作用强度与浓度呈正相关。
三、双酚A：纳米级的“构象破坏者”
双酚A（BPA）可通过诱导蛋白构象异常与“熔球态”形成、促进蛋白聚集与纤维化等方式，独立破坏蛋白稳定性。
1.诱导蛋白构象异常与“熔球态”形成
研究显示，低至100 ng/mL的BPA即可独立引发胶原蛋白构象破坏。紫外与荧光光谱表明，BPA通过暴露胶原蛋白的酪氨酸残基，导致蛋白主链松散、解折叠，形成不稳定的“熔球态”（Molten Globule）中间态。
圆二色谱（CD）和衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR）进一步证实，BPA处理后胶原蛋白的特征负吸收带消失，肽键羰基基团（C=O）发生宽化与位移，表明二级结构（如三螺旋结构）被破坏。
这一研究结果有力地证明，BPA可独立作用于蛋白构象，且低浓度（纳克级）即可产生显著效应。
2.促进蛋白聚集与纤维化
研究还发现，当BPA浓度升高至 1 μg/mL 时，处于“熔球态”的胶原蛋白会进一步聚集，荧光光谱出现明显红移；浓度达 30 μg/mL 时，透射电镜 (TEM) 观察到无序的粗纤维束形成，证明 BPA 可独立诱导蛋白从构象异常向聚集、纤维化发展。
此外，针对人血清白蛋白（HSA，一种常用模型蛋白）的研究指出，BPA通过氢键和疏水作用，独立占据HSA的特异性结合位点，导致HSA构象改变，进而降低其对其他配体的结合能力，同时增加蛋白聚集风险。
分子动力学模拟显示，BPA与HSA的结合能稳定在 -4.1 至 -3.9 kcal/mol，表明二者结合稳定，进一步支持 BPA 对蛋白稳定性的独立破坏作用。
3.对抗体类蛋白化学稳定性的潜在影响
尽管BPA对rh-GCSF的聚集无显著诱导作用，但针对抗体类蛋白（如IgG2）的研究提示，BPA可能通过氧化应激独立破坏抗体的化学稳定性。在未添加表面活性剂的IgG2制剂中，单独添加BPA会导致抗体的氧化产物（如甲硫氨酸氧化）和酸性降解产物含量升高，且降解程度随BPA浓度增加而加剧，而无BPA的对照组则无明显降解。
这表明BPA对蛋白稳定性的独立作用具有蛋白类型特异性，对抗体类蛋白的化学稳定性影响更为显著。
四、单个E/L成分独立作用的核心特征
根据已有的文献可知，己内酰胺低聚物与双酚A作为典型滤器E/L成分，其对蛋白稳定性的独立作用具有明确证据支撑，且呈现以下共性与差异：
| 特征 | 己内酰胺低聚物 | 双酚A（BPA） |
|---|---|---|
| 作用靶点 | 模型蛋白（rh-GCSF）、抗体 | 胶原蛋白、血清蛋白（HSA）、抗体 |
| 核心作用机制 | 氢键+疏水作用+静电作用，破坏二级结构 | 氢键+疏水作用，诱导“熔球态”+氧化应激 |
| 独立效应 | 直接诱导蛋白聚集（浓度依赖性） | 先破坏构象，后诱导聚集/纤维化/氧化降解 |
| 最低作用浓度 | ug级（对rh-GCSF） | ng级（对胶原蛋白） |
这些研究均通过“单一成分添加+对照实验”的设计，排除了其他E/L成分的干扰，明确证明：己内酰胺低聚物和双酚A无需与其他E/L协同，即可独立破坏蛋白稳定性，且作用机制与效应具有成分特异性。
五、E/L风险控制贯穿整个生命周期
E/L风险控制是生物制药质量控制的重要组成部分。通过深入了解E/L成分的作用机制，并采取有效的控制措施，包括风险分级、源头控制和过程控制，选择更安全的滤器，对工艺过程用组件的E/L成分进行监测，可以最大限度地降低E/L风险，确保生物药物的安全有效。
参考文献
[1] Zhang A, Singh S, Shirts M. Distinct aggregation mechanisms of monoclonal antibody under thermal and freeze/thaw-stresses revealed by hydrogen exchange. Pharm Res. 2012;29(1):236–50.
[2] Uversky V. Use of fast protein size-exclusion liquid chromatography to study the unfolding of proteins which denature through the molten globule. Biochemistry. 1993;32:13288–98.
[3] Prakash A, Medhi B, Chopra K. Granulocyte colony stimulating factor (GCSF) improves memory and neurobehavior in an amyloid-β induced experimental model of Alzheimer’s disease. Pharmacol Biochem Behav. 2013;110:46–57.
[4] Min Huang, et al. Impact of Extractables/Leachables from Filter Materials on the Stability of Protein‑Based Pharmaceutical Products, AAPS PharmSciTech, Volume 100, Issue 11, November 2011, Pages 4617-4630.
[5] Jenke DR, et al. Accumulation of extractables in buffer solutions from a polyolefin plastic container. Int J Pharm. Jun. 2005;297(1–2):120–33.
