细菌截留验证是确保除菌过滤器有效性的关键步骤，受国内外法规严格监管。本文详细阐述了验证范围的确定、过滤系统准备、过滤过程的控制、截留率计算及结果评估等步骤。
1. 概述
除菌过滤器是制药、生物技术等行业无菌生产过程中的核心组件，其主要功能是去除液体或气体中的细菌和其他微生物，以确保最终产品的无菌性。然而，仅凭除菌过滤器的供应商提供的性能指标并不能完全保证其在实际应用中的有效性。因此，必须进行细菌截留验证，以确认过滤器在特定工艺条件下能够有效去除目标细菌，从而保证产品的无菌安全。
细菌截留验证是通过实验证明除菌过滤器能够有效去除特定浓度和类型的细菌的科学过程。该验证过程通常包括选择合适的挑战菌、配制菌液、进行过滤实验、以及对过滤前后溶液进行微生物计数等步骤。
通过严格的细菌截留验证，可以为除菌过滤器的选择、使用和维护提供科学依据，确保生产过程的无菌性。
2. 依据的国内外法规
细菌截留验证是证明除菌过滤器有效性的关键环节，因此受到国内外法规的严格监管。以下是一些主要法规和指导原则：
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中国：《药品生产质量管理规范》（GMP）： 中国GMP对无菌药品的生产提出了明确要求，强调所有影响产品无菌性的操作，包括除菌过滤，都必须经过验证。虽然GMP没有直接规定细菌截留验证的具体方法，但强调验证方案应基于科学的风险评估，并模拟实际生产条件。
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美国：《美国药典》(USP)：USP <1211> "Sterilization and Sterility Assurance" 提供了无菌药品生产工艺的要求，其中明确指出除菌过滤器的使用必须经过验证，以证明其能够有效去除微生物。USP <1222> "Parametric Release for Terminally Sterilized Products" 则强调对灭菌过程的关键质量属性和过程参数进行控制，其中也包括过滤器的验证。
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欧盟：《欧盟药品生产质量管理规范》（EU GMP）附录1：无菌药品的生产：欧盟GMP附录1对无菌药品的生产提出了非常详细的要求，包括除菌过滤器的选择、验证、使用和完整性测试。其中明确要求除菌过滤器的验证应包括细菌截留实验，并对实验设计、挑战菌的选择、菌液浓度、过滤体积等提出了具体要求。
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ISO 22479:2022 Sterilization of health care products – Chemical indicators – General requirements：虽然此标准主要关注化学指示剂，但也强调了验证过程中对生物挑战菌的控制和评估，其原则同样适用于细菌截留验证。
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美国FDA《无菌药品生产用除菌过滤器指南》：该指南详细描述了除菌过滤器的验证要求，包括细菌截留实验的设计、执行和评估。指南强调实验应模拟实际生产条件，并对挑战菌的选择、菌液浓度、过滤体积、以及微生物计数方法等提出了具体建议。
法规要点总结：
- 强制性验证：法规普遍要求除菌过滤器在使用前必须进行细菌截留验证，以证明其能够有效去除微生物。
- 模拟实际生产条件：验证方案应尽可能模拟实际生产条件，包括产品特性、过滤压力、过滤速度、温度等。
- 选择合适的挑战菌：挑战菌应具有代表性，能够反映过滤器对微生物的截留能力。
- 控制菌液浓度：菌液浓度应足够高，以保证验证结果的可靠性。
精确的微生物计数：采用经验证的微生物计数方法，确保计数结果准确可靠。
3. 细菌截留验证的内容和步骤
细菌截留验证旨在通过实验证明除菌过滤器能够有效去除特定浓度和类型的细菌。 验证过程通常包括以下步骤：
确定过滤器类型和规格：
- 滤膜材质：明确滤膜材质（例如聚醚砜(PES)、聚偏氟乙烯(PVDF)、醋酸纤维素(CA)等）。不同材质的滤膜可能对细菌的吸附性不同，影响验证结果。
- 孔径：确认滤膜的孔径（通常为0.22μm 或 0.1μm）。孔径是影响细菌截留能力的关键因素。
- 规格：确定过滤器的规格（例如滤芯长度、过滤面积等）。规格会影响过滤速度和过滤容量。
- 批号：记录过滤器的批号，以便追溯。
- 供应商信息：记录过滤器的供应商信息，便于查阅相关技术资料。
确定应用范围和工艺参数：
- 产品类型：明确将要过滤的产品类型（例如注射剂、输液、生物制品等）。不同产品可能对滤膜的性能产生影响。
- 过滤工艺：详细描述过滤工艺，包括过滤方式（例如正压过滤、真空过滤等）、过滤系统（例如一次性过滤系统、多级过滤系统等）。
- 操作参数：明确过滤过程中的关键操作参数，例如：
- 过滤压力：记录过滤压力范围。过高的压力可能导致滤膜破损，过低的压力可能影响过滤速度。
- 过滤速度：记录过滤速度范围。过快的速度可能降低过滤效率。
- 温度：记录过滤温度范围。温度可能影响细菌的活性和滤膜的性能。
- 过滤体积：确定需要过滤的体积。过滤体积越大，验证的代表性越强。
- 产品pH值：记录产品的pH值。极端pH值可能影响滤膜的稳定性。
- 清洗和灭菌程序：描述过滤前后的清洗和灭菌程序。
挑战菌的选择：
- 法规要求：参考相关法规和指导原则，选择符合要求的挑战菌。
- 文献参考：查阅相关文献，了解常用的挑战菌及其特性。
- 风险评估：根据产品和工艺的特点，进行风险评估，确定最可能污染产品的细菌种类，并将其作为挑战菌的备选。
- 体积大小：选择体积较小的细菌，以挑战过滤器的截留能力。
- 产品相关性: 考虑在产品生产过程中可能存在的污染菌，增加验证的实际意义。
常用的挑战菌：Brevundimonas diminuta (ATCC 19146)：通常被认为是验证0.22μm除菌过滤器的标准挑战菌，体积小（约0.3-0.4 μm）。其他备选菌种：根据具体情况，可以选择其他细菌作为挑战菌，例如Serratia marcescens、Pseudomonas aeruginosa等。
过滤系统准备：
- 清洗和灭菌：对过滤系统进行彻底的清洗和灭菌，以避免污染。
- 完整性检查：在安装过滤器前，对过滤系统进行完整性检查，确保无泄漏。
- 过滤器安装：按照制造商说明：严格按照过滤器制造商的说明，正确安装过滤器。确保气密性：确保过滤器与过滤系统连接紧密，无泄漏。
- 预湿润：选择与产品相容的湿润剂，例如无菌水、缓冲液等。确保足够的湿润时间，使滤膜充分吸收湿润剂。
过滤过程：
- 控制参数：严格控制过滤压力、过滤速度和温度，使其与实际生产条件一致。
- 连续过滤：尽可能进行连续过滤，避免中断。
- 记录数据：详细记录过滤过程中的各项参数，例如压力、速度、温度、体积等。
- 取样：在过滤过程中，定期取样，用于微生物计数。
截留率计算：
计算公式：截留率 = (1 – 滤液细菌浓度 / 菌液细菌浓度) × 100%
对数降低值（LRV）：LRV = log10(挑战菌数量) – log10(滤液中菌的数量)，常用于评估过滤器性能。
结果评估：
- 参考相关法规和指导原则，确定截留率或LRV的标准。
- 平均值、标准差：计算实验数据的平均值和标准差，评估数据的离散程度
- 符合性判断：将实验结果与标准进行比较，判断过滤器是否符合要求。
- 趋势分析：对历史数据进行趋势分析，评估过滤器的长期性能。
- 不符合情况处理：如果不符合标准，应分析原因，并采取相应的措施，例如更换过滤器、优化过滤工艺等。
4. 测试难点和要点
细菌截留验证是一项复杂且精密的实验，需要严格控制各个环节，才能获得可靠的验证结果。 在验证过程中，可能会遇到以下难点：
- 挑战菌的选择：选择合适的挑战菌是一个关键的步骤。挑战菌应具有代表性，能够反映过滤器对其他细菌的截留能力。此外，挑战菌的培养和保存也需要严格控制，以保证其生物学特性和数量的稳定性。
- 菌液浓度的控制：菌液浓度过低可能会导致无法准确评估过滤器的截留效果，而菌液浓度过高可能会导致过滤器堵塞。因此，需要精确控制菌液浓度，并进行多次测定，以确保浓度准确可靠。
- 过滤过程的模拟：过滤过程应尽可能模拟实际生产条件，包括产品特性、过滤压力、过滤速度、温度等。如果模拟不充分，可能会导致验证结果与实际应用情况不符。
- 微生物计数的准确性：微生物计数是评估过滤器截留效果的关键环节。由于微生物数量通常较少，因此需要采用灵敏度高、准确性好的计数方法。此外，还需要严格控制操作过程，避免污染和误差。
- 数据的统计分析：验证数据的统计分析对于评估过滤器的截留效果至关重要。需要采用合适的统计方法，对实验数据进行分析，以确定过滤器的截留率是否符合预定的标准。
