1. 引言：溶剂是分离的隐形主角
在色谱实验中，大多数人的注意力都集中在色谱柱上。
但：
"溶剂，或溶剂混合物，在分离环境中扮演着至关重要的角色。理解和掌握溶剂的选择原则，是成为合格色谱工作者的必修课。"
溶剂不仅携带样品通过色谱柱，还与固定相、样品分子发生复杂的相互作用。一个选择不当的溶剂系统，可以让精心挑选的色谱柱前功尽弃。
本篇将从极性这一核心概念出发，系统讲解溶剂选择的理论与实践。
2. 极性：理解溶剂的钥匙
2.1 什么是极性
极性描述的是分子中电荷分布的不均匀程度：
极性分子示意： 非极性分子示意：
H₂O ← 电荷分离 Cl—Cl
O← ──H 对称分布
δ- δ+ 电荷均匀
| 类型 | 特点 | 代表溶剂 |
|---|---|---|
| 高极性 | 电荷分布不均，可形成氢键 | 水、甲醇、乙腈 |
| 中等极性 | 部分电荷分离 | 乙酸乙酯、二氯甲烷 |
| 低极性 | 电荷分布均匀 | 正己烷、石油醚 |
2.2 极性在色谱中的双重角色
这是理解色谱溶剂选择的关键：
正相色谱 vs 反相色谱
│ 【正相色谱】
│ 固定相：极性（硅胶、氧化铝）
│ 极性溶剂 → 在固定相上强吸附 → 占用活性位点 → 样品保留↓
│ 非极性溶剂 → 弱吸附 → 样品保留↑
│ 规律：极性↑ = 洗脱力↑ = 保留时间↓
│ 【反相色谱】
│ 固定相：非极性（C18键合硅胶）
│ 极性溶剂 → 与固定相作用弱 → 样品保留↑（被"挤"出）
│ 非极性溶剂 → 与固定相亲和 → 样品保留↓
│ 规律：有机相↑ = 洗脱力↑ = 保留时间↓
重要提醒：
在反相色谱中，"有机相比例增加"等同于"极性降低"（因为水/有机相混合物中，有机溶剂占的比例越大，整体极性越低）。这是新手容易混淆的概念。
2.3 介电常数：极性的量化指标
介电常数（ε）是衡量极性的客观指标：
| 溶剂 | 介电常数(ε) | 极性评估 |
|---|---|---|
| 正己烷 | 1.9 | 非极性 |
| 甲苯 | 2.4 | 非极性 |
| 四氢呋喃 | 7.6 | 中等极性 |
| 乙酸乙酯 | 6.0 | 中等极性 |
| 丙酮 | 20.7 | 极性 |
| 甲醇 | 32.7 | 高极性 |
| 水 | 78.5 | 极高极性 |
规律：ε越大，极性越强
3. 洗脱序列：溶剂洗脱力的排序
3.1 经典洗脱序列
洗脱序列（Eluotropic Series）按洗脱力从弱到强排列溶剂：
非极性 ───────────────────极性
石油醚 → 正己烷 → 四氯化碳 → 甲苯 → 氯仿 → 二氯甲烷
↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
最弱 弱 弱 中等 中等 中等
→ 乙酸乙酯 → 丙酮 → 乙醇 → 甲醇 → 水 → 乙酸
↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
中等 中等 强 强 很强 最强3.2洗脱序列
正相色谱（吸附色谱）洗脱序列：
氟化烷烃
↓
正戊烷
↓
异辛烷
↓
石油醚
↓
正己烷
↓
正庚烷
↓
环己烷
↓
二硫化碳
↓
四氯化碳
↓
异丙醚
↓
甲苯
↓
氯苯
↓
苯
↓
氯仿
↓
二氯乙烷
↓
二乙醚
↓
四氢呋喃
↓
二氯甲烷
↓
甲乙酮
↓
二氧六环
↓
乙酸乙酯
↓
吡啶
↓
丙酮
↓
正丙醇
↓
乙醇
↓
甲醇
↓
乙腈
↓
乙二醇
↓
乙酸
↓
水3.3 理解洗脱序列的要点
规律总结：
洗脱力影响因素
├──────────────────────────────────┤
│ ✓ 碳链增长 → 洗脱力减弱
│ 例：正己烷 > 正庚烷 > 正辛烷
│
│ ✓ 卤代增加 → 洗脱力增加
│ 例：正己烷 < 二氯甲烷 < 氯仿
│
│ ✓ 官能团极性增加 → 洗脱力增加
│ 例：醚 < 酮 < 酯 < 醛 < 醇
│
│ ✓ 分子量增加 → 洗脱力增加（同类溶剂）
│ 例：乙醇 < 正丙醇 < 正丁醇
洗脱力的本质：洗脱力取决于溶剂从固定相表面置换样品分子的能力。
4. 极性指数：Snyder的量化体系
4.1 什么是极性指数
极性指数（P’）是Snyder提出的量化溶剂极性的参数：
极性指数 = 参与三种相互作用能力的加权和
P' = Σ (Qᵢ × Sᵢ)
Qᵢ = 官能团参数（proton donor, proton acceptor, dipole）
Sᵢ = 权重因子4.2 常见溶剂的极性指数
| 溶剂 | P’ | 溶剂 | P’ |
|---|---|---|---|
| 正己烷 | 0.0 | 乙酸乙酯 | 4.4 |
| 苯 | 2.7 | 乙醇 | 4.3 |
| 二氯甲烷 | 3.1 | 甲醇 | 5.1 |
| 异丙醇 | 3.9 | 乙腈 | 5.8 |
| 四氢呋喃 | 4.0 | 乙酸 | 6.0 |
| 丙酮 | 5.1 | 水 | 10.2 |
4.3 极性指数的实战应用
用途1：预测混合溶剂的洗脱力
混合溶剂极性指数计算：
P'mix = Σ (φᵢ × Pᵢ')
其中：
φᵢ = 第i种溶剂的体积分数
Pᵢ' = 第i种溶剂的极性指数
例：甲醇/水 = 70/30 的反相流动相
P'mix = 0.7 × 5.1 + 0.3 × 10.2
= 3.57 + 3.06
= 6.63用途2：调整流动相的洗脱强度
当需要微调洗脱力时：
目标：让极性从5.5调整到6.0
方案1：增加甲醇比例（从70%→75%）
P'new = 0.75×5.1 + 0.25×10.2 = 6.4 ← 超过目标
方案2：改用乙腈
P'mix = 0.7×5.8 + 0.3×10.2 = 7.1 ← 洗脱力更强
→ 需要降低乙腈比例（70%→65%）
P'mix = 0.65×5.8 + 0.35×10.2 = 6.3 ← 接近目标5. 流动相的组成设计
5.1 等度洗脱 vs 梯度洗脱
| 特性 | 等度洗脱 | 梯度洗脱 |
|---|---|---|
| 定义 | 流动相组成恒定 | 流动相组成随时间变化 |
| 适用 | 组分数少、极性相近 | 组分数多、极性差异大 |
| 优点 | 简单、稳定、重现性好 | 分离度好、分析时间短 |
| 缺点 | 分析时间长、弱保留峰形差 | 设置复杂、平衡时间长 |
5.2 反相色谱梯度设计
典型的反相梯度程序：
有机相(%)
↑
90 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─┐
70 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ┐
50 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ┐
30 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ┐
10 ─ ─ ─ ─ ─ ┐
0─────────┴────┴────┴────┴────┴──→ 时间
0 5 10 15 20 25 (min)
├─ 平衡 ─┤├─ 梯度 ─┤├─ 冲洗 ─┤梯度设计原则：
梯度设计实用法则
├───────────────────────────────────────┤
│ 【起始点选择】
│ ✓ 组分极性范围宽 → 从低有机相开始（如5%）
│ ✓ 组分极性范围窄 → 从中间有机相开始（如40%）
│
│ 【梯度斜率】
│ ✓ 陡梯度（%B/分钟 大）→ 快速洗脱，但分辨率↓
│ ✓ 缓梯度 → 高分辨率，但分析时间长
│
│ 【梯度范围】
│ ✓ 一般从5%有机相到95%有机相即可覆盖大多数样品
│ ✓ 不需要到100%有机相
│
│ 【后运行（Post-run）】
│ ✓ 分析结束时用高有机相冲洗1-2分钟
│ ✓ 再平衡3-5分钟后进下一针
5.3 正相色谱梯度设计（洗脱序列法）
正相色谱中，梯度通过逐步改变溶剂极性实现：
典型正相分离程序：
步骤1：非极性溶剂（如正己烷）→ 洗脱非极性杂质
↓
步骤2：加入少量极性溶剂（如2%乙酸乙酯）→ 洗脱弱极性组分
↓
步骤3：增加极性溶剂比例（如10%乙酸乙酯）→ 洗脱中等极性组分
↓
步骤4：进一步增加极性（如30%乙酸乙酯）→ 洗脱较强极性组分
↓
步骤5：极性溶剂（如甲醇）→ 洗脱强极性组分正相梯度的注意事项：
正相色谱的梯度控制比反相更难。混合溶剂在固定相表面可能发生"选择性吸附"，导致实际洗脱力与预期不符。
6. 流动相添加剂
6.1 缓冲盐：控制pH的利器
对于可离子化的化合物，pH控制是关键：
pH对离子化化合物的影响：
pKa附近化合物行为：
完全离子化 完全质子化
←───────────────────→
pH 2 pKa 4.8 pH 8
↑
50%离子化
最难分离| 缓冲盐 | pH范围 | 特点 |
|---|---|---|
| 磷酸二氢钾 | 2.0-3.0 | 经典缓冲对，UV低吸收 |
| 磷酸二氢钠 | 2.0-3.0 | 类似磷酸二氢钾 |
| 醋酸铵 | 3.8-5.8 | LC-MS兼容 |
| 甲酸铵 | 3.0-4.0 | LC-MS兼容，更易挥发 |
| 碳酸氢铵 | 8.2-10.3 | LC-MS兼容 |
使用缓冲盐的黄金法则：
│ 缓冲盐使用规范 │
├────────────────────────────────────┤
│ 1. pH必须在缓冲盐的缓冲范围内（±1 pH单位）
│ 2. 浓度通常10-20 mM足以，过高会堵塞系统
│ 3. 使用后必须用高比例水相冲洗（至少10倍柱体积）
│ 4. 缓冲盐与有机相混合可能产生沉淀：
✓ 磷酸盐 + 高比例乙腈 → 可能沉淀
✓ 甲酸铵/醋酸铵 + 乙腈 → 安全
│ 5. LC-MS应用优先选择挥发性缓冲盐
6.2 其他常用添加剂
| 添加剂 | 用途 | 浓度 | 注意事项 |
|---|---|---|---|
| 三氟乙酸(TFA) | 离子对试剂，改善碱性化合物峰形 | 0.05-0.1% | 可能抑制MS信号 |
| 甲酸 | 增强正离子化，LC-MS常用 | 0.1-0.5% | 挥发，对pH控制弱 |
| 氨水 | 增强负离子化 | 0.1-0.5% | 需高纯度 |
| EDTA | 螯合金属离子，防止拖尾 | 0.1-1 mM | 注意溶解度 |
| 三乙胺(TEA) | 扫尾剂，屏蔽硅醇基 | 0.1-1% | 可能影响MS |
7. 溶剂纯化：细节决定成败
7.1 为什么溶剂需要纯化
杂质可能来自：
│ 溶剂杂质来源 │
├──────────────────────────────────┤
│ 【颗粒物】
│ └─ 来源：储存容器、生产过程
│ └─ 问题：堵塞筛板、损坏泵密封
│ 【水分】
│ └─ 来源：吸水、储存不当
│ └─ 问题：改变硅胶活性、正相保留时间漂移
│ 【UV吸收物质】
│ └─ 来源：氧化产物、聚合物
│ └─ 问题：UV检测基线噪声、假峰
│ 【金属离子】
│ └─ 来源：容器、管道
│ └─ 问题：螯合化合物拖尾
│ 【过氧化物】
│ └─ 来源：醚类溶剂长期储存
│ └─ 问题：爆炸风险、氧化样品
7.2 推荐的溶剂纯化方法
氧化铝过滤法：
操作流程：
1. 准备氧化铝柱
规格：25mm ID × 250mm高度
填料：150g Alumina Basic, Activity I
↓
2. 倒入待纯化溶剂（如正己烷）
体积：300mL
↓
3. 依靠重力过滤
流速：自然滴落
↓
4. 收集滤液
产物：无水、UV透明的纯化溶剂实测数据：
| 溶剂 | 纯化前50%透过nm | 纯化后50%透过nm | 收率 |
|---|---|---|---|
| 正戊烷 | 217nm | 217nm | 250mL |
| 正己烷 | 218nm | 218nm | 250mL |
| 环己烷 | 233nm | 234nm | 700mL |
| 二氯甲烷 | 280nm | 280nm | 400mL |
7.3 溶剂脱气
为什么要脱气：
空气在流动相中的危害：
1. 气泡形成
└─ 泵的活塞磨损
└─ 检测器噪声
└─ 保留时间漂移
2. 溶解氧
└─ 氧化敏感性样品
└─ 干扰电化学检测
└─ 促进细菌生长（水相）脱气方法对比：
| 方法 | 原理 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|---|
| 氮气吹扫 | 用氮气置换溶解氧 | 效果好、快速 | 需要氮气源 |
| 真空过滤 | 负压使气泡逸出 | 简单 | 蒸发损失 |
| 氦气吹扫 | 氦气置换 | 最彻底 | 成本高 |
| 在线脱气 | 半透膜抽真空 | 自动、可控 | 膜可能老化 |
推荐：HPLC系统使用在线脱气机，更可靠稳定。
8. 样品处理：从溶解到上样
8.1 样品溶解的原则
首要原则：样品必须完全溶解
样品溶解检查清单
├───────────────────────────┤
│ ✓ 用流动相溶解样品？
│ └─ 优先选择：溶解度最佳，与流动相匹配
│ ✓ 超声辅助溶解？
│ └─ 注意：可能引起局部发热、样品降解
│ ✓ 是否过滤？
│ └─ 必须！0.22μm或0.45μm滤膜
│ └─ 避免蛋白质类样品吸附滤膜
│ ✓ 是否离心？
│ └─ 颗粒物多时，先离心再过滤
8.2 溶解溶剂的选择
| 选择 | 理由 | 注意事项 |
|---|---|---|
| 流动相 | 与系统完全兼容 | 优先选择 |
| 强溶解力的溶剂 | 确保完全溶解 | 如最终进样体积小也可接受 |
| 弱洗脱力溶剂 | 初始聚焦更好 | 避免样品在柱头扩散 |
理想情况：
用流动相溶解样品，进样体积<流动相强度的5%
可接受情况：
用强溶解力溶剂（如DMSO）溶解，进样体积<1%流动相强度
8.3 进样量与样品容量
过载的类型：
样品过载的两种形式
├───────────────────────────────────┤
│ 【体积过载】
└─ 进样体积过大
└─ 现象：峰变宽、前沿或拖尾
└─ 解决：减小进样体积
│ 【质量过载】
└─ 进样质量过大
└─ 现象：峰保留时间提前、对称性变差
└─ 解决：稀释样品或增加固定相用量
典型进样量参考：
| 柱规格 | 分析级(μg) | 制备级(mg) |
|---|---|---|
| 4.6×150mm | 0.1-1 | 1-10 |
| 4.6×250mm | 0.5-5 | 5-50 |
| 10×250mm | 1-10 | 10-100 |
| 21×250mm | 5-50 | 50-500 |
8.4 样品预处理技术
液-液萃取：
典型流程：
样品水溶液
─ 加入有机溶剂（如乙酸乙酯）
─ 涡旋混合
─ 离心分层
─ 收集有机层
└─ 浓缩或直接进样
适用：从水相提取有机化合物固相萃取(SPE)：
SPE步骤流程：
1. 活化：用1-2mL甲醇活化小柱
↓
2. 平衡：用1-2mL水/缓冲盐平衡
↓
3. 上样：样品溶液通过小柱
↓
4. 淋洗：用适当溶剂淋洗去除杂质
↓
5. 洗脱：用目标物洗脱剂收集目标物
↓
6. 浓缩：氮气吹干后复溶SPE填料选择：
| 填料 | 机制 | 适用场景 |
|---|---|---|
| C18 | 反相保留 | 非极性到中等极性化合物 |
| C8 | 反相保留（比C18弱） | 中等极性化合物 |
| 硅胶 | 正相保留 | 极性化合物 |
| NH2 | 弱阴离子交换 | 酸性化合物 |
| SCX | 强阳离子交换 | 碱性化合物 |
9. 样品容量与吸附等温线
9.1 什么是样品容量
样品容量是指色谱柱能够在保持分离效果的前提下处理的最大样品量：
容量曲线示意：
Rs
↑
│ ╲
│ ╲___________←─ 容量极限点
│ ╲ （Rs开始下降）
│ ╲
│ ╲
│ ──────────────────
├──────────────────────────────→ 样品质量
↑ ↑
低质量 高质量
（线性范围） （过载区域）9.2 影响容量的因素
| 因素 | 影响 |
|---|---|
| 固定相类型 | C18 > C8 > C4（碳载量越高，容量越大） |
| 比表面积 | 高比表面积 = 高容量 |
| 活性 | 高活性硅胶容量更高 |
| 流动相组成 | 弱洗脱力条件容量更高 |
10. 实战案例：优化一个混合溶剂系统
案例背景
问题：分离三种黄酮类化合物（极性差异大）
初始方法：
- 流动相：甲醇/水 = 50/50
- 结果：极性最小的化合物保留太强，洗脱时间>30分钟
Step 1：分析问题
│ 三种化合物的log P值和预期行为：
│ 化合物A (极性大): log P ≈ 1.2 → 保留弱，洗脱快
│ 化合物B (中等): log P ≈ 2.5 → 保留适中
│ 化合物C (非极性): log P ≈ 4.0 → 保留太强！
│ 根因：50%甲醇对化合物C洗脱力不足 Step 2：尝试不同有机相
| 有机相 | 介电常数 | 极性指数 | 对化合物C的洗脱效果 |
|---|---|---|---|
| 甲醇 | 32.7 | 5.1 | 需要70%才能快速洗脱 |
| 乙腈 | 37.5 | 5.8 | 60%可快速洗脱 |
| THF | 7.6 | 4.0 | 50%可快速洗脱，但UV截止波长高 |
Step 3：梯度优化
最终方案（梯度洗脱）：
梯度程序：
- 0-5 min: 40% B (乙腈)
- 5-25 min: 40% → 80% B (线性)
- 25-30 min: 80% B
- 30-35 min: 40% B (平衡)
结果：
- 化合物A: 3.2 min
- 化合物B: 12.5 min
- 化合物C: 21.3 min
- 总分析时间: 25 min ✓
- 所有峰基线分离 (Rs > 1.8) ✓Step 4：添加缓冲盐改善峰形
问题：化合物B略有拖尾（可能含酚羟基）
优化：在水相中加入20mM甲酸铵(pH 3.5)
结果：
- 峰形对称性从0.65改善到0.95
- 分离度进一步提升
- 方法更稳健11. 特殊应用：正相色谱的溶剂系统设计
11.1 正相色谱溶剂选择要点
正相色谱的溶剂选择比反相更具挑战性：
正相色谱溶剂选择原则
✓ 首选非极性溶剂（如正己烷、环己烷）作为主体
✓ 添加极性改性剂（如乙酸乙酯、乙醇）来调节洗脱力
✓ 极性改性剂比例通常2-20%即可
✓ TLC筛选是开发正相方法的好工具
⚠️ 正己烷/乙醇体系：注意乙醇的含水量
⚠️ 二氯甲烷体系：对某些样品有反应
11.2 正相色谱常用混合体系
| 主体溶剂 | 极性改性剂 | 典型比例 | 适用场景 |
|---|---|---|---|
| 正己烷 | 乙酸乙酯 | 1-20% | 通用 |
| 正己烷 | 二氯甲烷 | 5-30% | 中等极性化合物 |
| 正己烷 | 乙醇 | 0.5-10% | 极性化合物 |
| 环己烷 | 乙酸乙酯 | 1-15% | 替代正己烷 |
| 石油醚 | 乙醚 | 1-20% | 传统体系 |
12. 本篇要点总结
【极性与洗脱力】
✓ 正相：极性↑ = 洗脱力↑ = 保留时间↓
✓ 反相：有机相↑ = 洗脱力↑ = 保留时间↓
✓ 洗脱序列按洗脱力从弱到强排列
【极性指数P’】
✓ 量化溶剂的极性特征
✓ 可计算混合溶剂的总体极性
✓ 指导流动相微调
【流动相设计】
✓ 等度洗脱：简单、稳定、适合少量组分
✓ 梯度洗脱：高效、适合复杂样品
✓ 缓冲盐：控制pH，改善离子化化合物分离
✓ 缓冲盐浓度10-20mM足矣，过高会堵塞系统
【溶剂纯化】
✓ 氧化铝过滤可有效去除水分和UV吸收杂质
✓ 脱气是防止气泡和氧化的必要步骤
【样品处理】
✓ 样品必须完全溶解并过滤
✓ 优先用流动相溶解样品
✓ 进样体积<5%流动相强度以保证聚焦
✓ SPE是复杂的生物样品和环境样品的前处理利器
【样品容量】
✓ Rs开始下降的点即为容量极限
✓ 高比表面积、高碳载量 = 高容量
思考与讨论
- 你的实验室在溶剂纯化方面有什么规范？遇到过哪些因溶剂问题导致的实验失败？
- 对于复杂样品的流动相开发，你更倾向于系统筛选还是经验判断？依据是什么？
参考资料：Sorbtech《Liquid Chromatography Handbook for Classical Column Applications》
