“ 本文介绍了预灌封注射器中钨元素的来源，及微量钨对某些蛋白类药物产生的不利影响的机制，介绍了评估蛋白对钨敏感性的方法，这对选择适宜的药品包装材料具有重要意义。”
最近，不少朋友提出一个问题：钨元素到底会对蛋白类药物产生什么影响?它是否同样对所有生物药物都具有不良影响 ?
伯朗氏E&L认为，产生这样的问题，背后主要原因可能是：药企对药品包装材料的关注度逐渐增加；药包材厂家在产品推广过程，强调了钨元素的问题。
在实际生产环境中，我们既不能谈“钨”色变，也不能视若无“钨”。我们希望能通过这篇小短文，帮助各位看官理解 钨元素对蛋白药物影响的机制与原因 ，供各位一线制药的专家参考，基于风险管理的思路，综合考虑成本与效果，依据自家药物的性质，选择合适的包装材料，减少不良事件的发生。
【钨（W）：一种重金属；原子序数74；元素周期表第六周期的VB族金属。】
【无明显细胞毒作用，对人体健康具有双向影响，人体残留量非常小，对患者潜在的毒性风险低。】
1｜预灌封注射器中钨的来源
在预灌封注射器玻璃针管制造过程中,需要在玻璃管一端拉制一个尖角或锥形，然后使用高熔点的金属针在高温下穿过玻璃管制造出针头隧道。
由于钨具有极高的熔点（ 约3410°C）和优异的机械强度 ，传统上常用钨合金针实现该隧道的形成。
在制作注射器针头隧道的过程中，钨针在接近1200°C的温度下与加热的硼硅酸盐玻璃接触，钨针表面在该过程中被氧化，同时碱性硼酸盐从玻璃转移到钨针。
钨氧化物在500°C-800°C下升华，在后续的冷却过程中沉积在注射器尖端开口。
根据火焰设置参数或其他成型工艺参数，钨的沉积量和溶解度因不同的工艺和不同批次的注射器而异。
在最终包装和灭菌之前，通常会使用80°C注射用水冲洗预灌封注射器，然而由于钨沉积物水溶性较差，不能被完全去除。
预灌封注射器内存在的钨化合物包括WO3 、H2 WO4 和Na2 WO4 ，尤其是Na2 WO4 ，可在酸性条件下形成聚钨酸盐阴离子。具体可参照以下反应式。
在高温下：
2｜蛋白聚集的背后机理
由于纯氧化钨残留物（如W O2 、WO3 ）溶解度有限，通常情况下的浸出量引发后期风险的可能性低。
但是， 钨针在1200°C下暴露于硼硅酸盐玻璃中可能会形成聚钨酸钠物质（WO4 2- ） ，该物质为水溶性物质，在预灌封注射器的正常使用条件下可能会浸出，进而导致蛋白质颗粒和聚集体的形成。
对于蛋白类生物制剂来说,它们的三维空间结构对其治疗作用至关重要。而 钨可以通过氧化反应、络合反应、离子交换 等几种机制导致蛋白质的构象改变从而失去活性，最终影响蛋白类药物的稳定性。
▼ 氧化反应：钨化合物可以作为氧化剂，通过氧化蛋白质的胺基酸如甲硫氨酸和半胱氨酸,使蛋白质发生构象改变和活性损失。特别是蛋白质分子表面区域的此类氧化反应会更直接影响其生物活性。
▼ 络合反应：钨可以与蛋白质分子表面或内部的配体如羟基、羧基、氨基等发生络合作用。这种作用会改变蛋白质原有的化学环境，影响其构象稳定性和生物活性。
▼ 离子交换：由于钨离子的电荷密度较高，它可以与蛋白质上的其他阳离子如钠、铝等发生离子交换作用。这使蛋白质结构由原来适应的离子环境改变为适应钨离子，蛋白质构象和活性也随之改变。
▼ 亲和力作用：钨还可以通过与蛋白质分子表面或蛋白质与基质间的非共价作用如范德华力和氢键发生作用，这会破坏原有的相互作用网络，使蛋白质发生构象变化和功能损失。
3｜影响钨与蛋白作用的因素
据文献报道，只发现部分蛋白类制剂在预灌封注射器中会形成可见沉积物，这意味着钨化合物仅在某些特定因素下会引发部分蛋白聚集，关键的影响因素包括：
▼ 溶液的pH值、离子强度
▼ 蛋白浓度和钨浓度
▼ 特定的钨化合物 （如WO3 、H2 WO4 和Na 2 WO4 ）
pH值和 离子强度 4｜不同蛋白对钨的敏感性
文献报道了四种不同的蛋白（BSA 牛血清白蛋白、Iysozyme溶菌、Ovalbumin卵白蛋白、Chy A糜蛋白酶原）对钨的敏感性。
四种蛋白带有不同等电点（pI），在不同pH值下对钨的敏感度不同。例如Iysozyme（pI 10.5-11），在pH 5时带正电荷，由于静电相互作用，会与聚钨酸盐阴离子形成蛋白聚集体。Ovalbumin（pI 4.5-4.7）在pH 5时接近等电点为中性，未观察到蛋白聚集体的形成。
由此可知，在相同pH下，蛋白的等电点影响其对钨的敏感性。
那小伙伴接下来要问了，如何评估钨对特定的蛋白类产品的影响程度？
分光光度法浊度测定法 、尺寸排阻色谱法（SEC-HPLC） 用于评价蛋白对钨的敏感性。圆二色谱（CD） 、红外光谱（IR） 或拉曼光谱 ，用于分析蛋白质在溶液和固态中的构象。研究蛋白对钨的敏感性时，商业购买的酸化Na 2 WO4 可用于模拟钨的聚集，也可以采用注射器的含钨提取物。
具体可供参考的资料：（可以通过本订阅号下的微信客服索取）
▼ FDA《工业指南——治疗性蛋白质产品的免疫原性评估》，建议进行可浸出物和可提取物评估，建议进行加标研究，以评估钨诱导蛋白质聚集的风险。
▼ PDA第73号技术报告（TR 73），对生物技术应用的预填充注射器，建议进行加标研究，以确定钨的影响。
｜ 减少钨对蛋白影响的策略 ｜
我们可以考虑从以下几个方面减少或避免对产品的不良影响：
● 采用额外、特殊的清洁程序，最大限度的减少钨沉积；● 采用不含钨的替代品，例如陶瓷针替代钨针，选择无金属的鲁尔锁注射器；● 调整药品配方，增加螯合剂如有机酸、磷酸盐、EDTA等；● 提高药品的离子强度和pH值，可阻断聚钨酸阴离子的形成，减少蛋白和钨之间的作用力。聚钨酸盐的形成需要酸性pH，在pH>6条件 下可以有效减轻钨对多数蛋白质的负面影响。但pH的最终选择需要综合考虑蛋白质等电点和自身稳定性。
● 用塑料材质注射器（COP／COC）替代玻璃注射器。
参考文献
1. Risk Assessment and Mitigation Strategies for Immune Responses to Therapeutic Proteins: the FDA Perspective.
2. Toxicological Summary for Tungsten and Selected Tungsten Compounds, Research Triangle Park, North Carolina. 2003.
3. Saki Yoneda, Takahiro Marunoet. Influence of Protein Adsorption on Aggregation in Prefilled Syringesz. J Pharm Sci. 2021, 110(11): 3568-3579.
4. Wei Liu, Rob Swift, Gianni Torraca, et al. Root Cause Analysis of Tungsten-Induced ProteinAggregation in Pre-filled Syringes. PDA J Pharm Sci and Tech 2010, 64:11-19.
5. Christopher D. Mensch and Harrison B. Davis. Inhibition of Tungsten-Induced Protein Aggregation by Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide. PDA J Pharm Sci and Tech 2012, 66:2-11.
伯朗氏实验室对市面常用注射器中的钨残留问题进行了深入研究。如果您也对这个话题感兴趣,快来给我们的文章点个赞吧! 给小编亿点动力
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