一次性生产组件系统（SUS）的可浸出物（PERL）如抗氧剂168的降解物—双(2,4-二叔丁基苯基)磷酸酯（bDtBPP）对细胞生长有潜在影响。本文讨论了bDtBPP的生成途径、细胞抑制和如何消除bDtBPP的影响，介绍了针对bDtBPP痕量检测的特定提取方法，以测试膜材特定浸出物的水平。
一次性生产组件系统（SUS）中与工艺设备相关的可浸出物（PERL）对分子生物制剂的产品质量和工艺性能，如细胞生产率，有着潜在的影响。这种影响主要取决于浸出物与工艺流体的相互作用，这种作用受多种条件影响，包括可浸出化合物的种类、细胞类型和工艺条件。
在生物技术行业中，实现细胞生长的一致性至关重要。为了提高最终药品的产出，行业正朝着提高细胞密度和蛋白质滴度的方向发展。
然而，一些生物制药企业在使用一次性袋子进行细胞培养时遇到了细胞生长不一致的问题。研究发现，一种常见的聚乙烯薄膜中的抗氧化剂降解产物双(2,4-二叔丁基苯基)磷酸酯（bDtBPP）,可能会抑制某些中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系的生长。
bDtBPP的来源
双（2,4-二叔丁基苯基）-磷酸酯（bDtBPP）一直是一次性生物工艺系统的可提取物和浸出物测试领域广泛讨论的主题。bDtBPP来源于三（2,4-二叔丁基苯基）亚磷酸酯（商品名Irgafos 168®）的降解，Irgafos 168属于有机膦酸盐辅助抗氧化剂，是聚乙烯（一种通常用作生物工艺容器中接触工艺流体的聚合物）配方中常见的抗氧化剂添加剂。
Irgafos 168的氧化形式（三(2,4 -二-叔丁基苯基)磷酸酯）是抗氧剂168的降解物，在伽马射线照射下进一步降解为bDtBPP。
图 1(a) 抗氧剂168 (b) 168氧化物 (c) bDtBPP
bDtBPP的负面影响
使用几种哺乳动物细胞系和加标bDtBPP的生长培养基进行的细胞生长实验已证明，双（2,4-二叔丁基苯基）-磷酸酯（bDtBPP）在低水平下抑制细胞生长，既往研究发现，bDtBPP（0.025 – 0.110 mg/L）对中国仓鼠卵巢（CHO）细胞生长产生负面影响。
目标物提取和分析
伯朗氏实验室以及开发了一种针对bDtBPP痕量检测的特定提取方法，采用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS/MS）测试不同来源的一次性袋子提取液中bDtBPP浓度，方法检测限（LOD）为7ppb。
采用50%乙醇作为提取介质，比较了灭菌方式、提取温度和提取时间对bDtBPP提取量的影响。详细可参考《基于LC-MS法对不同提取条件下生物反应袋中bDtBPP含量分析》
试验结果表明：
- 未经辐照灭菌的袋子提取液中未检出bDtBPP，表明暴露于辐射是形成bDtBPP的必要条件。
- 研究结果表明随着提取温度升高， bDtBPP的提取量增加。
- 随着提取时间延长， bDtBPP的提取量增加，最终平衡浓度受两相（聚合物材料与液体）之间分配系数控制。开始时增加速率较快，7天后增加速率减缓，14天后逐渐达到平衡。
图2 不同提取时间对bDtBPP提取量的影响
如何消除bDtBPP的影响
消除 bDtBPP 有害影响的选择包括：
- 从配方中完全去除 Irgafos 168
- 通过调节薄膜制造参数来控制Irgafos 168氧化
- 使用不同的抗氧化剂
- 改变伽马辐射水平或条件
但是，去除抗氧化剂可能会导致薄膜性能不佳，并且替代抗氧化剂（及其降解产物）的特性可能不如Irgafos 168。我们需要知道，不一定需要完全去除Irgafos 168，因为许多含有Irgafos 168的一次性袋子在细胞培养应用中表现良好。
bDtBPP对细胞生长的抑制作用应细胞而异，通过优化配方中的Irgafos 168水平，可以实现薄膜抗氧化和良好的细胞生长性能。
根据上文得知，bDtBPP由Irgafos 168氧化物降解生成，亚磷酸盐类抗氧化剂的氧化是由热量不可逆地触发的，研究表明，挤出步骤（film extrusion）被确定为薄膜制造过程中Irgafos 168氧化的主要来源，其氧化水平与挤出机温度和薄膜输出速率相关。
研究发现，相同的树脂在不同挤出步骤下，薄膜A的Irgafos 168氧化率为40-60%，薄膜B的Irgafos 168氧化率高达90%。
基于已确定的相关性，可以通过在容器制造之前测量薄膜中Irgafos 168氧化物水平来预测经辐照灭菌后工艺容器的细胞培养性能。
市面上的选择
- 思拓凡（Cytiva）与希悦尔公司（Sealed Air Corporation）合作多年开发的Fortem™薄膜，经证明不会产生影响细胞培养的Irgafos降解物水平。
- 赛多利斯（Sartorius）的Flexboy®袋子和新的Flexsafe®平台，解决了一次性袋子中细胞生长性能的挑战问题，Flexboy®袋子接触层不含抗氧剂168氧化物。
讨论
对于使用一次性容器维持细胞生长而言，Irgafos 168及其氧化水平取决于薄膜的聚合物类型，抗氧化剂对于保持薄膜的稳定性是必需的，在薄膜挤出和伽马辐照过程中保护聚合物不受氧化。为了确保细胞生长得当，应优化并严格控制这些添加剂的浓度，这要通过整个供应链中密切透明的合作来实现。
伯朗氏实验室拥有丰富的可提取化合物专有数据库，已帮助多家公司鉴定和定量双（2,4-二叔丁基苯基）磷酸酯（bDtBPP）和许多其他化合物。
文献
- 广州伯朗氏检测技术有限公司，基于LC-MS法对不同提取条件下生物反应袋中bDtBPP含量分析，广州化工 ， 2023年18期
- Identification of a leachable compound detrimental to cell growth in single-use bioprocess containers, A J Pharm Sci Technol. 2013 Mar-Apr;67(2):123-34
- Investigating the pre-lethal cytotoxic effects of bis(2,4-di-tert-butylphenyl)phosphate on Chinese hamster ovary cells using high content analysis, J Biotechnol. 2021 Feb 20:328:59-71.
- https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/bioprocessing/knowledge-center/fortem-technology-analytical-results
- https://shop.sartorius.com.cn/cn/c/liquid-storage-shipping/2d-liquid-storage-shipping-5-ml–20-l/flexboy-2d-bags#
