生物制药下游工艺：为什么最终制剂里很少检出浸出物？

一个困扰行业很久的现象：生物制药生产过程中，SUS组件与液体接触的表面积巨大（可达数百平方米），但最终成品中检出的浸出物浓度往往极低——甚至低于检测限。这不符合直觉。

是提取研究的数据有误？还是提取研究根本没有代表性？

Sartorius团队（Paudel et al., 2019, Eur J Pharm Sci）做了一件非常实在的事：在真实的生物制药下游工艺条件下，向工艺液体中投加8种典型浸出物模型化合物，然后一个步骤一个步骤地测——离心、深层过滤、除菌过滤、病毒过滤，看每一步究竟能清除掉多少。

> 结果发现了一个被长期忽视的机制：浸出物汇（Leachables Sinks）。

Leachables Sinks 特指细胞收获、除菌过滤、病毒过滤等下游工艺步骤—— 它们会通过细胞吸附、膜截留等作用，显著去除工艺流体中的工艺相关浸出物（PERLs），相当于浸出物在工艺流中的「汇集清除点」。

背景：提取研究和实际工艺的”悖论”

SUS（一次性使用系统）的塑料组件——储液袋、管路、过滤器外壳、连接器——都会向工艺液体释放可提取物（Extractables），这部分是提取研究测到的。

但在实际的生物制药生产中，从细胞培养上清液到最终制剂，中间经过多步纯化：细胞收获（离心/深层过滤）→ 除菌过滤 → 蛋白A层析 → 病毒过滤 → 超滤/透析（UF/DF）→ 制剂灌装。

问题是：这些纯化步骤会不会同时清除掉浸出物？ 如果会，那提取研究的数值就是保守估计的上限，实际工艺中真正的暴露量远低于提取数据。

研究方法：用8种典型浸出物追踪四个关键下游步骤

研究团队选择了8种典型的浸出物模型化合物（LMCs），覆盖了从高亲水性到高疏水性的完整极性范围：

测试的四个关键下游步骤：

1. 离心（CHO细胞收获）
2. 深层过滤（Sartoclear Dynamics®）
3. 除菌过滤（Sartopore® 2，0.2 µm聚醚砜膜）
4. 病毒过滤（Virosart® HF）

结果一：离心收获—细胞本身就是”浸出物捕集器”

把8种LMC投加到CHO细胞培养液中，然后离心分离细胞和上清液，结果令人意外：

上清液中几乎检测不到任何LMC——它们被CHO细胞和细胞碎片完全吸附，随离心沉淀一起被清除了。

计算各化合物的细胞吸附系数 Kd：

Kow越高的疏水性化合物，Kd越大，被细胞吸附得越彻底——DEHP（Log Kow=7.88）虽然Kow最高，但可能因为浓度绝对值较低，残留量不是最高的。真正棘手的是Tris-DtBPP（Kd仅4），它几乎不被CHO细胞吸附。

结论：细胞收获（离心）步骤几乎可以完全清除疏水性浸出物，这是第一个有效的”浸出物汇”。

结果二：深层过滤——塑料滤材成为第二道防线

深层过滤（Sartoclear Dynamics®，聚乙烯滤材+硅胶管路+硅藻土助滤剂）比离心更进一步：

• 疏水性化合物：bDtBPP、DtBP、DtBBQ、BHT、DEHP、BPA、Tris-DtBPP——几乎100%被清除
• 亲水性化合物：DtBHPPA（上清液中残留约75%）——唯一漏网的化合物

DtBHPPA是一种有机酸（pKa≈5），在pH≈7的CHO培养液中以离子态存在（去质子化），亲水性显著增强，对疏水性吸附材料的亲和力大幅下降。

> 这是整个研究中唯一一种在下游工艺中未被显著清除的化合物——这提示：对于有机酸类浸出物，需要额外关注。

同时，深层过滤中使用的PE（聚乙烯）滤材本身就具有高吸附能力—对Tris-DtBPP的吸附效果比CHO细胞单独作用时好得多，这说明塑料组件在释放浸出物的同时，某种程度上也在吸附其他来源的浸出物，形成动态平衡。

结果三：除菌过滤——滤膜是有效的浸出物清除步骤

除菌过滤（Sartopore® 2，聚醚砜膜）的清除效果：

• 缓冲液条件：8种LMC中6种清除率65%~100%，BHT和DtBBQ清除率略低但仍有效
• BSA存在时：清除率显著下降——BSA作为血清蛋白，能与疏水性有机物结合（它在人体内就是负责运输脂溶性物质的载体），相当于”背着”浸出物穿过滤膜
• 溶菌酶存在时：清除率反而略升高——溶菌酶对滤膜有表面修饰效应，增强了对浸出物的吸附能力

关键发现：蛋白质的存在对除菌过滤清除浸出物的效果有显著影响——BSA减少了清除，溶菌酶增强了清除。这意味着：在含高浓度蛋白的原液（process stream）中，滤膜清除浸出物的效果可能弱于纯缓冲液条件。

结果四：病毒过滤—最大表面积提供最强吸附能力

病毒过滤（Virosart® HF，0.01 µm聚醚砜中空纤维膜）在整个工艺流程中表面积最大——最高可达100 m²，是除菌过滤的数倍。

结果：
– 缓冲液条件：清除率60%~100%，与除菌过滤类似
– IVIg（静脉用人免疫球蛋白）条件：清除模式与缓冲液高度一致，说明中空纤维膜材料本身是强效的浸出物吸附介质，蛋白的存在对病毒滤膜吸附能力的影响相对较小

用乙醇冲洗滤膜后，可定量回收被吸附的LMC，建立了完整的质量平衡，进一步证实了吸附机制。

关键洞察：DtBHPPA—唯一漏网的浸出物

整个研究中，唯一在所有下游步骤中均未显著清除的化合物是 DtBHPPA（3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸）。

这是一种来自Irganox® 1010/1076抗氧化剂降解的有机酸，在pH 7条件下呈离子态，亲水性较强，不易被细胞、滤膜等疏水性介质吸附。

这提示了一个重要的工程端考量：有机酸类浸出物——尤其是来自抗氧化剂降解产物——是生物制药工艺中最需要关注的潜在风险物质，因为它们最有可能”穿透”下游各清除步骤，最终到达制剂成品。

实务意义：从”来源控制”到”来源+汇双重管理”

这项研究的真正价值，在于它揭示了一套“浸出物来源-分布-汇”完整图谱：

上游组件释放浸出物
↓
细胞培养收获（离心/深层过滤）→ 第一道清除（疏水性化合物）
↓
除菌过滤 + 病毒过滤 → 第二道清除（膜吸附）
↓
UF/DF（已有文献证明可清除1000倍）→ 第三道清除
↓
制剂灌装（最终容器系统）→ 最终评估节点

只有经历以上所有步骤仍然存在的浸出物，才需要纳入成品安全性评估。

这对于风险评估的指导意义在于：

1. 提取研究数据 ≠ 成品中实际暴露量：提取研究给出的是最坏情况下的最大可能释放量，实际工艺中的暴露量往往低一到三个数量级
2. 工艺参数影响浸出物汇效率：高细胞密度、BSA浓度、滤膜类型等均影响清除效率
3. 特殊化合物需要额外关注：DtBHPPA等亲水性有机酸类浸出物，更容易穿透工艺到达成品

结语

这篇研究的结论对行业有深远的指导意义：生物制药企业的E&L评估策略，不应该只盯着”上游组件释放了多少”，而应该建立来源+汇的双重评估框架——用提取研究数据做保守上限估计，同时用下游工艺清除数据做现实暴露量评估。

对于正在进行USP <665>合规的企业来说，这意味着：基于工艺数据进行浸出物风险评估，可以比纯提取研究数据保守估计更接近实际情况——关键是要有足够的数据支撑”汇”的有效性。

如果你的生物制药生产过程中遇到了浸出物风险评估的困惑，欢迎与伯朗氏实验室交流——我们可以协助建立完整的E&L评估框架，涵盖提取研究、工艺条件评估和安全性分析全流程。

参考文献：

1. Paudel K. et al., Quantitative Characterization of Leachables Sinks in Biopharmaceutical Downstream Processing. Eur J Pharm Sci, 2019, doi:10.1016/j.ejps.2019.105069.
2. Hauk A. et al., From extractables to exposure data: Sensitivity analysis of extrapolation algorithms with focus on USP 665. Eur J Pharm Sci, 2025, 207, 107026.
3. Magarian N. et al., Clearance of extractables and leachables from single-use technologies via ultrafiltration/diafiltration operations. Biotechnol Prog, 2016, 32, 718–724.
4. Hammond M. et al., Identification of a leachable compound detrimental to cell growth in single-use bioprocess containers. PDA J Pharm Sci Technol, 2013, 67, 123–134.