细胞基因治疗（ATMP）：一次性耗材 E&L风险 E&L 与CHO 毒性试验解读

细胞与基因治疗（ATMP）生产过程中，一次性组件提取物风险评估长期存在一大难题：传统基于PDE、SCT的毒理学评价体系高度依赖成熟毒理数据库，而新型塑料添加剂、未知浸出物往往缺少充足安全数据。

MTT、CHO增殖抑制等常规细胞毒性试验仅能识别明显致死效应，难以捕捉提取物引发的细胞分化偏移、功能扰动等亚毒性改变。Cell Painting Assay（CPA）表型筛选技术，正在填补ATMP领域SUS材料生物学风险评估的空白。

在细胞和基因治疗（ATMP）生产中，塑料组件与活治疗细胞直接接触，这是和传统重组蛋白制药最本质的区别。

一旦提取物或浸出物干扰治疗细胞增殖、分化、基因表达，将直接影响细胞产品临床疗效。传统毒理学评估框架在此场景下存在明显短板：PDE/ADE推导需要完备的体内毒理数据，而大量新型高分子助剂缺少公开安全数据库。

Pahl等人2024年于《Scientific Reports》发布的研究，搭建起基于无靶标表型筛选的新型评估体系。研究利用Cell Painting Assay（CPA）对45类常用塑料提取物、两种商业化SUS实际提取样品开展高通量筛选，同时和标准细胞毒性试验、QSAR计算毒理交叉比对，为毒理数据匮乏场景下的材料风险评估提供可行方案。

一、ATMP行业痛点：传统E&L评估框架存在固有局限

传统生物制药E&L评估逻辑建立在一个基础假设：浸出物迁移至药液后，通过给药途径进入人体，依托毒理学终点计算安全阈值（PDE/SCT）。该套评估范式无法直接平移至高级治疗产品生产。

ATMP的独有挑战体现在两方面：

• 第一，治疗细胞在生产阶段持续暴露于耗材提取物。提取物带来的危害不一定表现为急性细胞死亡，更多体现为分化潜能下降、转录组偏移、细胞功能受损。这类亚毒性损伤无法依靠MTT、细胞增殖抑制试验充分检出。

• 第二，一次性组件多属于生产辅助耗材，并不会最终进入成品输注体系，监管预期与药物活性成分辅料存在区分。但从临床风险角度，材料干扰细胞质量带来的损失不可忽视，仅依靠GMP流程管控不足以充分论证安全性。

二、Cell Painting Assay（CPA）：无靶标高内涵表型筛选技术原理

Cell Painting Assay是基于高内涵成像的无靶标表型筛选技术，借助多重荧光染料特异性标记多种亚细胞结构，将化合物诱发的细胞形态变化可视化，实现无预设靶点的广谱生物学活性筛查。

【Cell Painting试验流程示意图】

标准试验流程（研究采用U2OS人骨肉瘤细胞系）

1. 细胞接种至多孔培养板，与不同浓度待测提取物共同孵育；
2. 对细胞实施固定、细胞膜透化处理；
3. 多重荧光同步标记：细胞核、肌动蛋白骨架、高尔基体、线粒体、细胞膜；
4. 高内涵成像设备采集图像，单视野可提取合计1716项定量细胞形态学特征；
5. 将样本特征图谱与化合物参考数据库比对，输出Biosimilarity生物学相似性评分。

Biosimilarity评分核心意义

研究团队划分出12类生物学响应簇，每一类对应一套特征性活性模式。待测物质形态学图谱和参考簇标准图谱比对，得到0~100%相似度分值。

该方法最大优势：无需预先设定作用靶点，即可系统性筛查未知提取物潜在生物学扰动效应。

三、45种塑料提取物CPA高通量筛查：关键试验结果解读

研究选取45种制药塑料体系典型提取物，覆盖抗氧剂、增塑剂、润滑剂、加工助剂等品类，获得大量具备指导价值的试验结论：

1. N-月桂基二乙醇胺：整体生物活性最强。该物质具备溶酶体蓄积特性（log P＞2，pKa 9.2），CPA检测显示大量细胞特征通道出现显著扰动；成骨分化抑制试验中≥10 µM即可诱发毒性，应重点管控。
2. bDtBPP、4-正壬基酚、TPO光引发剂：CPA诱导活性低于20%，生物学扰动偏弱；当前主流一次性生产耗材中已极少使用或含量被严格管控。
3. DPP、TPP：和DNA合成相关生物学簇呈现中等相似度，提示物质存在干扰核酸代谢通路的潜在风险，需要加强剂量效应研究。

四、方法学横向对比：CPA与ASTM标准CHO细胞毒性试验优劣分析

研究同步依照ASTM E3231-19规范，采用CHO DG44细胞开展传统增殖抑制试验，两种技术形成清晰互补关系。

试验证实：CPA能够在细胞未出现明显死亡前识别早期表型改变。对于治疗窗口狭窄的ATMP细胞产品，亚毒性预警价值突出。
应用策略建议：CPA用于初筛与表型定性；CHO细胞毒性试验用于后续定量验证、剂量效应评估。

五、QSAR计算毒理：作为风险评估的辅助支撑手段

研究同时引入定量结构-活性关系（QSAR）模型开展预测。

• 优势：无需获取标准品，仅依靠化学结构式快速预判潜在毒性；
• 局限性：预测可靠性高度依赖训练数据集。针对结构新颖的新型助剂，预测结论可信度显著下降。

因此行业共识：QSAR仅作为前期初筛辅助参考，不能单独作为风险判定依据。

六、落地应用指南：CPA评估体系对ATMP药企的实践价值

这套评估方案核心价值，是为缺少毒理学历史数据的一次性生产组件提供合规补充评估路径。

当耗材供应商无法提供完整E&L数据包、现有物质难以依托ICH Q3D、USP <1664>框架推导PDE时，CPA可以输出三类关键信息：

1. 哪些提取物匹配已知高风险生物活性模式；
2. 提取物诱发细胞形态扰动是否超出企业内控可接受阈值；
3. 优先锁定高风险物质，精简后续细胞毒性验证清单。

推荐落地场景

1. 新引入直接接触细胞SUS组件的前期风险筛查；
2. 供应商提供的E&L数据包存在缺口时，作为补充生物学证据；
3. 高风险细胞接触耗材周期性再评估项目。

参考文献

1. Pahl I. et al., Assessing biologic/toxicologic effects of extractables from plastic contact materials for advanced therapy manufacturing using cell painting assay and cytotoxicity screening. Sci Rep, 2024, 14:5933. DOI: 10.1038/s41598-024-55952-3.
2. ASTM E3231-19, Standard Practice for Assessment of CHO Cell Culture Growth Inhibitory Factor.
3. Pahl A. et al., Novel approaches to assess biocompatibility of materials for manufacturing of biopharmaceuticals and advanced therapy medicinal products. Eur J Pharm Biopharm, 2023.
4. Bray M.A. et al., Cell Painting, a multi-parametric assay for induced phenotypic profiling of compounds. Methods Mol Biol, 2017.